ইমিউনোফ্লোরেসেন্স: যুক্তি, প্রোটোকল এবং অ্যাপ্লিকেশন - জীববিদ্যা - 2025

Immunofluorescence একটি শক্তিশালী কৌশল covalently প্রতিপ্রভ অনু জোড়া একটি কঠিন সমর্থন সম্মুখের সংশোধন সেল নমুনা নির্দিষ্ট লক্ষ্যমাত্রা শনাক্ত করতে অ্যান্টিবডি ব্যবহার immunostaining হয়।

এই কৌশলটিতে ইমিউনোলজিকাল সুনির্দিষ্টতার সাথে মাইক্রোস্কোপিক পর্যবেক্ষণ জড়িত রয়েছে, এটি জীবিত বা মৃত কোষগুলি পর্যবেক্ষণ করা সম্ভব করে যা ক্ষুদ্র পরিমাণে অ্যান্টিজেনগুলি উপস্থাপন করতে পারে। এটি গবেষণার ক্ষেত্রে এবং বিভিন্ন প্যাথলজির ক্লিনিকাল নির্ণয়ে উভয়ই ব্যবহৃত হয়।

কার্ডিওমায়োসাইট কোষগুলিতে অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের ইমিউনোবেলিং (সূত্র: উইকিমিডিয়া কমন্সের মাধ্যমে PS1415)

এই কৌশলটি মূলত গুণগত (কিছু পরিমাণগত বৈকল্পিক সহ) একটি ফ্লুরোফোরের পণ্য সংকেত দ্বারা একটি নমুনার দৃশ্যধারণের সাথে বিশেষত করতে হবে, যা কোনও অ্যান্টিবডিতে আবদ্ধ একটি ফ্লুরোসেন্ট অণু এবং নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যে উত্তেজিত হতে সক্ষম ।

সেলুলার প্রসঙ্গে প্রোটিনের উপস্থিতি / অনুপস্থিতি এবং উপকোষীয় অবস্থান অধ্যয়ন করা খুব দরকারী। এই কৌশলটি প্রাথমিকভাবে ক্লিনিকাল সেটিংয়ে ব্যবহৃত হয়েছিল যেমন ইনফ্লুয়েঞ্জা হিসাবে ভাইরাস নির্ণয়ের জন্য এবং পরে আরও অনেক সংক্রামক রোগের জন্য।

এটি একটি অত্যন্ত সংবেদনশীল কৌশল এবং উপযুক্ত মাইক্রোস্কোপি সরঞ্জামগুলির সাথে এটির খুব ভাল রেজোলিউশন থাকতে পারে। এটির পর্যবেক্ষণের জন্য কনফোকল বা এপিফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলির ব্যবহার প্রয়োজন।

তবে, খুব জনপ্রিয় হওয়া সত্ত্বেও, এটি অ-নির্দিষ্ট প্রতিপ্রভ যা কিছু পটভূমির "শব্দ" উত্পন্ন করে তা অর্জনের ক্ষেত্রে কিছু গুরুত্বপূর্ণ সমস্যাগুলি উপস্থাপন করতে পারে, যা প্রায়শই ফলাফলের পর্যাপ্ত পড়া সীমাবদ্ধ করে।

ভিত্তি

অ্যান্টিবডি এবং অ্যান্টিজেনের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া প্রতিক্রিয়ার জৈবিক ঘটনাগুলির শোষণের উপর ভিত্তি করে ইমিউনোফ্লোরেন্সেন্স। এটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের উত্তেজনাপূর্ণ ফ্লুরোসেন্ট অণু দ্বারা এই প্রতিক্রিয়াটির দৃশ্যায়ন বা সনাক্তকরণের সাথে বিশেষভাবে করতে হবে।

অ্যান্টিবডি হ'ল একটি ইমিউনোগ্লোবুলিন প্রোটিন যা সক্রিয় বি কোষ থেকে লুকানো থাকে, যা বিশেষত একটি অ্যান্টিজেনের বিরুদ্ধে উত্পন্ন হয়, যা এটি উচ্চ সখ্যতা এবং নির্দিষ্টতার সাথে আবদ্ধ হতে পারে। ইমিউনোফ্লোরাসেন্স আইজিজি ইমিউনোগ্লোবুলিন ব্যবহার করে, যা রক্তের সিরামে দ্রবণীয় পাওয়া যায়।

অ্যান্টিবডিগুলি দুটি সংক্ষিপ্ত (হালকা) এবং দুটি দীর্ঘ Y- আকারের (ভারী) পেপটাইড চেইনের সমন্বয়ে 950 কেডি পর্যন্ত অণু থাকে। হালকা এবং ভারী দুটি শৃঙ্খলা দুটি ডোমেইনে বিভক্ত: একটি পরিবর্তনশীল, অ্যান্টিজেনকে সনাক্ত করতে সক্ষম এবং অন্যটি ধ্রুবক বা সংরক্ষণিত, প্রতিটি প্রজাতির বৈশিষ্ট্য।

অ্যান্টিজেনগুলি কার্যত অণু হিসাবে সংজ্ঞায়িত হয় যা অ্যান্টিবডি দ্বারা স্বীকৃত হতে পারে এবং বেশিরভাগ ক্ষেত্রে প্রোটিন হয় are যখন কোনও প্রাণী কোনও অ্যান্টিজেনের সংস্পর্শে আসে, তখন প্রতিরোধ ব্যবস্থাটির লিম্ফোসাইটগুলি সক্রিয় হয়, এর বিরুদ্ধে নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি তৈরি করে এবং এটি প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা হিসাবে কাজ করে।

একটি অ্যান্টিজেন, যেমন একটি প্রোটিন, উদাহরণস্বরূপ, অ্যান্টিবডি দ্বারা একাধিক এপিটোপ বা স্বীকৃতির সাইট থাকতে পারে, সুতরাং অ্যান্টিজেনের সংস্পর্শে আসা প্রাণীর সিরাম একই প্রোটিনের বিভিন্ন অঞ্চলের বিরুদ্ধে বহুভুজ প্রতিষেধক থাকতে পারে।

ইমিউনোফ্লোরেন্সেন্স, তখন কোনও প্রাণীকে শুদ্ধ করার জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিজেনের বিরুদ্ধে বহুভৌত অ্যান্টিবডি তৈরির ক্ষমতাকে কাজে লাগায় এবং পরবর্তীকালে অন্যান্য প্রসঙ্গে একই অ্যান্টিজেন সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করে।

কিছু কিছু ইমিউনোফ্লোরসেন্স কৌশলগুলির জন্য সর্বাধিক ব্যবহৃত ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক বা অণুগুলির মধ্যে হ'ল ফ্লোরোসেসিন আইসোথিয়োকায়ানেট (এফআইটিসি), টেট্রেমেথাইলারহোডামাইন আইসোথিয়োকায়ানেট -5 এবং 6 (টিআরআইটিসি), অনেক সায়ানাইন যেমন Cy2, Cy3, Cy5 এবং Cy7 এবং আলেক্সা ফ্লুওরি নামক রঞ্জক যেমন আলেক্সা ফ্লুওর®৪৪৮।

প্রোটোকল

ইমিউনোফ্লোরাসেন্স প্রোটোকল অনেকগুলি কারণের উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয়, তবে সাধারণ ভাষায় এটি পদক্ষেপগুলির একটি রৈখিক ক্রমকে অন্তর্ভুক্ত করে:

• প্লেট এবং কোষ প্রস্তুত
• নমুনা স্থিরকরণ
• Permeabilization
• রোধক
• ইমিউনোস্টেইনিং বা ইমিউনস্টেইনিং
• সমাবেশ এবং পর্যবেক্ষণ

-Preparation

নমুনার মধ্যে

নমুনাগুলির প্রস্তুতি নির্ভর করবে তাদের প্রকৃতি এবং কী ধরণের অভিজ্ঞতার জন্য। সাসপেনশনতে কোষের ব্যবহারের সাথে জড়িত সবচেয়ে সহজ কেসটি নীচে ব্যাখ্যা করা হবে।

স্থগিতাদেশের ঘরগুলি, অর্থাত্ কোনও তরল সংস্কৃতির মাধ্যমগুলিতে প্রথমে সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা পৃথক করা উচিত এবং তারপরে একটি বাফার সমাধান বা আইসোমোটিক "বাফার" দিয়ে ধুয়ে ফেলতে হবে, যা তাদের অখণ্ডতা সংরক্ষণ করে।

সাধারণত, পিবিএস নামে পরিচিত একটি ফসফেট-স্যালাইন বাফার ব্যবহার করা হয়, এতে কোষগুলি পুনরায় সাজানো হয় এবং এই মিশ্রণটি আবার সংস্কৃতি মাধ্যমের কোষগুলি মুক্ত করার জন্য কেন্দ্রীভূত করা হয়, এতে হস্তক্ষেপকারী পদার্থ থাকতে পারে।

ব্লেডের

মাইক্রোস্কোপিক পর্যবেক্ষণের জন্য ব্যবহৃত স্লাইডগুলি যেখানে কোষগুলি পরবর্তীতে একই প্রবাহের চিকিত্সার জন্য স্থির করা হবে সেগুলিও যত্ন সহকারে প্রস্তুত থাকতে হবে।

এগুলি পলি-লাইসিনের সমাধান সহ একটি সংশ্লেষিত পলিমার দ্বারা আচ্ছাদিত বা "সংবেদনশীল" হয় যা কোষ এবং দৃ support় সমর্থনের মধ্যে "আণবিক আঠা" হিসাবে কাজ করবে, তাদের অ্যামিনো গ্রুপগুলির ইতিবাচক চার্জগুলির মধ্যে বৈদ্যুতিন সংযোগের জন্য ধন্যবাদ এবং কোষ কোষ প্রোটিন নেতিবাচক চার্জ।

নমুনা স্থিরকরণ

এই প্রক্রিয়াটি কোষের অভ্যন্তরীণ অবস্থানটি অক্ষত রাখার জন্য কোষের ভিতরে পাওয়া প্রোটিনগুলিকে স্থির করে নিয়ে গঠিত। ব্যবহৃত অণুগুলি অবশ্যই সব ধরণের কোষের ঝিল্লি অতিক্রম করতে এবং সমবায় প্রোটিনগুলির সাথে জালগুলি তৈরি করতে সক্ষম হতে হবে।

ফর্মালডিহাইড এবং প্যারাফর্মালডিহাইড, গ্লুটারালডিহাইড এবং এমনকি মিথেনল ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়, যার সাহায্যে কোষের নমুনাগুলি একটি নির্দিষ্ট সময়ের জন্য সজ্জিত হয় এবং তারপরে আইসোমোটিক বাফার দ্রবণ দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়।

কক্ষগুলি স্থির করার পরে, তারা পলি-লাইসিনের সাথে সংবেদনশীল শীটগুলির সাথে সংযুক্ত থাকা অবিরত করে।

Permeabilization

যে ধরণের পরীক্ষা করা হয় তার উপর নির্ভর করে অধ্যয়নের অধীনে থাকা কোষগুলিকে বিকাশ করা বা না করা প্রয়োজন। যদি সন্ধান করা হয় তা যদি কোষের পৃষ্ঠের নির্দিষ্ট প্রোটিনের অবস্থান, উপস্থিতি বা অনুপস্থিতি জানতে হয় তবে প্রবেশযোগ্যতা প্রয়োজন হবে না।

অন্যদিকে, আপনি যদি কোষের অভ্যন্তরে কোনও প্রোটিনের অবস্থানটি জানতে চান তবে প্রবেশযোগ্যতা অপরিহার্য এবং এটি কোষের ঝিল্লিগুলিকে বিকাশ করতে সক্ষম ডিটারজেন্ট ট্রাইটন এক্স -100 দিয়ে নমুনাগুলি উদ্বেগ নিয়ে গঠিত।

রোধক

সমস্ত ইমিউনোলজিক কৌশলগুলির একটি মৌলিক পদক্ষেপ অবরুদ্ধ। পদ্ধতির এই পর্যায়ে, ব্লকিং সংবেদনশীল শীটগুলিতে, পলি-লাইসিন অণুগুলির সাথে সমস্ত সাইটগুলি আবরণ নিয়ে গঠিত যা কোষগুলি মেনে চলেন না। এটি হ'ল এটি কোনও অনিচ্ছাকৃত ইউনিয়নকে আটকায়।

সাধারণত পিবিএস বাফারে বোভাইন সিরাম অ্যালবামিন (বিএসএ) দিয়ে সমাধানগুলিতে ব্লক করার জন্য ব্যবহার করা হয় এবং সর্বোত্তম ফলাফলগুলি এই সমাধানটির সাথে আরও বেশি সময় উতস্রাবের সময় প্রাপ্ত হয়। ব্লকিং সহ প্রতিটি পদক্ষেপের পরে, অবশিষ্ট সমাধানটি ধুয়ে ফেলা প্রয়োজন।

ইমিউনোস্টেইনিং বা ইমিউনস্টেইনিং

ইমিউনোস্টেইনিং বা ইমিউনোস্টেইনিং পদ্ধতিটি সরাসরি বা অপ্রত্যক্ষভাবে ইমিউনফ্লুরোসেন্স (নীচে দেখুন) তার উপর নির্ভর করবে।

যদি এটি প্রাথমিক বা সরাসরি ইমিউনোফ্লোরাসেন্স হয় তবে নমুনাগুলি কাঙ্ক্ষিত অ্যান্টিবডিগুলির সাথে সঞ্চারিত হবে, যা অবশ্যই ফ্লুরোসেন্ট রঙিনের সাথে মিলিত হওয়া উচিত। ইনকিউবেশন পদ্ধতিতে এমন একটি দ্রবণে অ্যান্টিবডি হ্রাস করা থাকে যা বিএসএও রাখবে তবে কম অনুপাতে।

কেসটি যখন গৌণ বা অপ্রত্যক্ষভাবে ইমিউনুফ্লোরোসেন্সের হয়, তখন পর পর দু'বার ইনকিউবেশন করা উচিত। প্রথমে কাঙ্ক্ষিত অ্যান্টিবডিগুলির সাথে এবং তারপরে অ্যান্টিবডিগুলির সাথে যা প্রাথমিক ইমিউনোগ্লোবুলিনগুলির ধ্রুবক অঞ্চলগুলি সনাক্ত করতে সক্ষম। এটি এই গৌণ অ্যান্টিবডিগুলি যা সমবায়ভাবে ফ্লুরোফোরে আবদ্ধ।

সরাসরি ইমিউনোফ্লোরেন্সের ক্ষেত্রে, বিভিন্ন ফ্লুওরোফোরের সাথে প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলিতে যতক্ষণ না প্রাথমিক অ্যান্টিবডি থাকে ততক্ষণ এই কৌশলটি অত্যন্ত বহুমুখী is

পরোক্ষ ইমিউনোফ্লোরোসেন্সে একসাথে লেবেলিংয়ের জন্য, প্রতিটি প্রাথমিক অ্যান্টিবডি একটি পৃথক প্রাণীর মধ্যে উত্পাদিত হয় তা নিশ্চিত করা প্রয়োজন, পাশাপাশি প্রতিটি মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি একটি পৃথক ফ্লুরোফোরের সাথে মিলিত হয়েছে তাও নিশ্চিত করা দরকার।

ব্লক করার মতো, অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ইনকিউবেশন আরও ভাল সময়ের জন্য আরও ভাল ফলাফল দেয়। প্রতিটি পদক্ষেপের পরে এমন অতিরিক্ত অ্যান্টিবডিগুলি ধুয়ে ফেলা উচিত যা নমুনাগুলির সাথে আবদ্ধ হয় না এবং গৌণ প্রতিরোধ ক্ষমতাতে গৌণ অ্যান্টিবডি যুক্ত করার আগে এটি ব্লক করা প্রয়োজন।

নির্দিষ্ট কৌশলগুলি অন্যান্য দাগ ব্যবহার করে যা ইমিউনোস্টেইনের সাথে সম্পর্কিত নয়, যেমন ডিএপিআই ফ্লুরোফোরের সাথে পারমাণবিক ডিএনএ দাগ করা।

সমাবেশ এবং পর্যবেক্ষণ

ফ্লুরোফোরসের সাথে চূড়ান্ত ইনকিউবেশন সময় স্যাম্পলগুলি অন্ধকারে থাকা প্রয়োজন। মাইক্রোস্কোপের অধীনে পর্যবেক্ষণের জন্য, অ্যান্টিবডিগুলির সাথে মিলিত ফ্লুরোফোরগুলির প্রতিভা সংরক্ষণের জন্য কিছু উপাদান ব্যবহার করা সাধারণ।

প্রকারভেদ

প্রত্যক্ষ এবং অপ্রত্যক্ষ প্রতিরোধ ক্ষমতা গ্রাফিক সংক্ষিপ্তসার (উত্স: উইকিমিডিয়া কমন্সের মাধ্যমে Westhayl618)

প্রত্যক্ষ বা প্রাথমিক প্রতিরোধ ক্ষমতা

এটি ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহারের মাধ্যমে অ্যান্টিজেন সনাক্তকরণের সাথে সম্পর্কিত। এই কৌশলটি ব্যবহারের মূল সুবিধাটি হ'ল তার গতি, তবে, প্রসেসের ক্ষেত্রে বিশেষভাবে বাঁধাইয়ের অনেকগুলি ঘটনা ঘটতে পারে, বিশেষত মানব সেরার অধ্যয়ন করার সময়, কারণ তারা অত্যন্ত বিজাতীয় অ্যান্টিবডিগুলিতে সমৃদ্ধ।

অপ্রত্যক্ষ বা গৌণ প্রতিরোধ ক্ষমতা

এটি "স্যান্ডউইচ" কৌশল হিসাবেও পরিচিত এবং এর মধ্যে দুটি পদক্ষেপে কৌশলটির বিকাশ জড়িত। প্রথমটি হ'ল অ-ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার এবং এটির আগ্রহের অ্যান্টিজেনের সাথে আবদ্ধ হওয়া।

এই প্রথম অ্যান্টিবডি (যা এখন অ্যান্টিজেন হিসাবে পরিবেশন করবে) এর ধ্রুবক অঞ্চলের বিপরীতে এটি সনাক্তকরণে সক্ষম একটি দ্বিতীয় অ্যান্টিবডি ব্যবহৃত হয়, যা ফ্লুরোসেন্ট অণুর সাথে যুক্ত।

ফ্লুরোসেন্ট সিগন্যালের উপস্থিতিটি প্রথম অ-ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি এবং আগ্রহের অ্যান্টিজেনের মধ্যে নির্দিষ্ট স্বীকৃতির ফলাফল হবে; এই প্রথম অ্যান্টিবডিটির উপস্থিতি দ্বিতীয়টির মতো, যা লেবেলযুক্ত এবং যার ফলে অ্যান্টিজেনের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতি নির্ধারণ করা যায়।

ডাইরেক্ট ইমিউনোফ্লোরেন্সেন্সের চেয়ে অনেক বেশি সময় গ্রহণকারী কৌশল হওয়া সত্ত্বেও (যেহেতু এটিতে আরও একটি ইনকিউবেশন পদক্ষেপ অন্তর্ভুক্ত), এই কৌশলটিতে অধ্যয়ন করা প্রতিটি অ্যান্টিজেনের জন্য একটি ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি ডিজাইন জড়িত না, যার ফলস্বরূপ, অর্থনৈতিক দিক থেকে, আরও কার্যকর

তদ্ব্যতীত, এটি সংকেত পরিবর্ধনের ক্ষেত্রে আরও সংবেদনশীল কৌশল, যেহেতু একাধিক মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি প্রাথমিক অ্যান্টিবডিটির ধ্রুবক অঞ্চলে আবদ্ধ হতে পারে, এইভাবে ফ্লুরোসেন্ট সংকেতের তীব্রতা বৃদ্ধি করে।

অ্যাপ্লিকেশন

যেমনটি আগে উল্লেখ করা যেতে পারে, ইমিউনোফ্লোরসেন্স একটি অত্যন্ত বহুমুখী কৌশল, যা বৈজ্ঞানিক এবং ক্লিনিকাল ক্ষেত্রে বিভিন্ন উপায়ে ব্যবহৃত হয়েছে। এটি বহু জীব সম্পর্কিত পরিবেশগত, জেনেটিক এবং শারীরবৃত্তীয় প্রশ্নের উত্তর দিতে ব্যবহার করা যেতে পারে।

ক্লিনিকাল অ্যাপ্লিকেশনগুলির মধ্যে এটি কিছু চর্মরোগের সরাসরি রোগ নির্ণয়ের জন্য ব্যবহার করা হয়, হয় অধ্যয়নরত রোগীদের এপিথেলিয়াল টিস্যুতে প্রত্যক্ষ বা অপ্রত্যক্ষ ইমিউনোফ্লোরেন্স ব্যবহার করে।

ইমিউনোফ্লোরসেন্স কৌশলগুলি ইন্ট্রেনিউক্লিয়ার এবং সাইটোপ্লাজমিক মাইক্রোটুবুলস, অ্যাক্টিন এবং সম্পর্কিত প্রোটিন, 10nm ফিলামেন্টস এবং সাইটোপ্লাজম, ঝিল্লি এবং কোষের প্রাচীরের অন্যান্য উপাদানগুলির দৃশ্যধারণের জন্য ইউিসিসেলুলার জীবগুলিতে যেমন ইস্টের মতো এককোষী জীবগুলিতে উপলব্ধ।

তথ্যসূত্র

1. অ্যাব্যাকাম, ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি এবং ইমিউনোফ্লোরাসেন্স প্রোটোকল। Abcam.com থেকে প্রাপ্ত
2. গ্রাফ, সি। (2012) ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক। লিকা-মাইক্রোসিস্টেমস ডট কম থেকে প্রাপ্ত
3. মিলার, ডিএম, এবং শাকেস্ট, ডিসি (1995)। ইমিউনোফ্লোরেসেন্স মাইক্রোস্কোপি। সেল জীববিজ্ঞানের পদ্ধতিগুলিতে (খণ্ড 48, পৃষ্ঠা 365-394)। একাডেমিক প্রেস, ইনক।
4. ওডেল, আইডি, এবং কুক, ডি (2013)। ইমিউনোফ্লোরেসেন্স কৌশলসমূহ। জার্নাল অফ ইনভেস্টিগেটিভ ডার্মাটোলজি, ১৩৩, ১-৪।
5. মুদ্রক, বিজেআর, অ্যাডামস, এইএম, ড্রুয়েন, ডিজি, এবং ব্রায়ান, কে। (1991)। খামিরের জন্য ইমিউনোফ্লোরেসেন্স পদ্ধতি। এনজাইমোলজির পদ্ধতিগুলিতে (খণ্ড 194, পৃষ্ঠা 565–602)। একাডেমিক প্রেস, ইনক।
6. শ্যাফার, এম।, ওরসি, ই। ভি, এবং উইদেলক, ডি (1964)। জনস্বাস্থ্য ভাইরাসবিদ্যায় ইমিউনোফ্লোরোসেসেন্সের প্রয়োগ। ব্যাকটিরিওলজিকাল রিভিউ, 28 (4), 402-408।
7. ভ্রিলিং, ইজি, এবং অ্যান্ডারসন, ডিএম (1996)। ফাইটোপ্ল্যাঙ্কটন গবেষণায় ইমিউনোফ্লোরাসেন্স: অ্যাপ্লিকেশন এবং সম্ভাব্য। জে: ফাইকোল, 32, 1–16।